Investigación y Desarrollo

Identificando nuevos blancos con potencial terapéutico.

IBT, Inmuno BioTecnología

El Centro IBT tiene como misión principal detectar investigaciones que describan nuevos blancos con potencial terapéutico, ofreciendo establecer acuerdos de participación con las respectivas contrapartes, levantar fondos para diseñar y desarrollar anticuerpos recombinantes que modulen a estos blancos, y dar origen a nuevas biomoléculas que puedan transformarse en biofármacos con propiedad industrial.

Las principales líneas de investigación, tanto básico-clínica como biotecnológica, se agrupan de la siguiente manera:

ANTICUERPOS RECOMBINANTES

El Centro IBT ha desarrollado:

AcQTNF se une específicamente a TNF recombinante humano mediante ELISA.

- Anticuerpo quimérico anti factor de necrosis tumoral humano recombinante (AcQTNF).

Éste fue generado a partir de un hibridoma productor de anticuerpo monoclonal murino contra la citoquina. Sus secuencias de nucleótidos codificantes para los dominios variables de la cadena pesada y liviana son diferentes a las secuencias reportadas para anticuerpos recombinantes anti TNF. Mediante ELISA, se demuestra que el AcQTNF se une a TNF recombinante humano (figura).
Además, el AcQTNF mostró un efecto inhibitorio sobre la citotoxicidad de TNF, en un ensayo sobre una línea celular murina con distintas concentraciones de la citoquina. Este comportamiento fue similar al observado con Infliximab, un anticuerpo quimérico anti TNF comercial.
Asimismo,  el Centro IBT está generando anticuerpos biosimilares, detacándose un anticuerpo quimérico anti CD20, biosimilar a Rituximab.


Análisis de la unión del AcHu-ErbB3 a células tumorales gástricas mediante citometría de flujo.

- Anticuerpo completamente humano anti ErbB3 (AcHu-ErbB3).

Éste fue desarrollado a partir de una genoteca o biblioteca de genes, generada en el Centro IBT, que codifican regiones variables de cadenas pesada y liviana de inmunoglobulinas humanas unidas en una sola cadena (scFv) y expresadas en la superficie de fagos filamentosos (fagos-scFv).

La reactividad de AcHu-ErbB3 se analizó mediante ELISA utilizando el receptor ErbB3 recombinante y por citometría de flujo con células AGS y MKN-45 de cáncer gástrico, uniéndose específicamente a la proteína recombinante y nativa expresada en las líneas celulares mencionadas.


Diagrama esquemático de biblioteca fago-scFv

- Genoteca o biblioteca de genes que codifican regiones variables de cadenas pesada (VH) y liviana (VL) de inmunoglobulinas humanas unidas en una sola cadena (scFv), expresadas en la superficie de fagos filamentosos (fago-scFv).

Para la generación de esta biblioteca, el Centro IBT diseñó un nuevo procedimiento que permite mejorar la eficiencia de la fusión de las cadenas VH y VL logrando mayor título de fagos con alta variabilidad (Sotelo et al., 2012, mAbs).

Esta genoteca permitirá seleccionar cadenas scFv con especificidad contra diferentes blancos, los que pueden ser modificados por ingeniería genética para generar anticuerpos funcionales.


APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS

Una de las aproximaciones terapéuticas más novedosas en el tratamiento del cáncer es el uso de anticuerpos monoclonales terapéuticos dirigidos selectivamente contra antígenos tumorales, los cuales se usan aditivamente a la cirugía.

Como se observa en la figura, estos anticuerpos interfieren en los mecanismos de invasión y metástasis del tumor al bloquear la unión de los factores de crecimiento a su ligando. Además, pueden lisar directamente a las células tumorales, a través de la activación del sistema del complemento o por el reclutamiento de células citolíticas por naturaleza (células NK).


DESARROLLO DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN OPTIMIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS

Diagrama esquemático de diferentes contructos de promotores de expresión en céluas eucariontes en etapa de investigación en el Centro IBT.

Utilizando el conocimiento en biología celular, genética molecular e inmunología molecular, se realiza I+D para producir un sistema de expresión que aumente la producción de anticuerpos recombinantes en bio-reactores. Esto permitirá generar cantidades suficientes de anticuerpos con potencial terapéutico para ejecutar ensayos pre-clínicos y clínicos de Fase I y II. Mediante este nuevo sistema de expresión optimizado, se potenciará el desarrollo de nuevos biofármacos y/o biogenéricos. El Centro IBT se ha enfocado en modificar las etapas de síntesis y secreción de proteínas. En la etapa de síntesis proteíca, particularmente a nivel de transcripción, estamos modificando promotores de vectores de expresión, con el fin de evitar el silenciamiento típico de los genes recombinantes una vez integrados en el genoma de la célula huésped durante la producción de proteínas en cultivos prolongados. Por otro lado, se trabaja en mejorar la capacidad de secreción de proteínas mediante la activación controlada de la respuesta a la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (UPR).

Los investigadores del Centro IBT, además, realizan investigación básica en el conocimiento y búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos en el tratamiento de enfermedades crónicas como artritis y cáncer gástrico.

INVESTIGACIÓN BÁSICA EN ARTRITIS

- Generación y caracterización de células dendríticas (DCs) tolerogénicas para el restablecimiento de la tolerancia en autoinmunidad.

Se ha establecido que las DCs pueden inducir tanto inmunogenicidad como también tolerancia. En ratones, nuestro laboratorio demostró la capacidad de DCs tolerogénicas, generadas con cortos estímulos con lipopolisacárido (LPS), de reducir la severidad de la artritis inducida por colágeno (CIA). Las DCs administradas a los ratones, junto con mostrar una reducida expresión de moléculas co-estimuladoras, secretaron altas concentraciones de IL-10 y TGF-β, mientras presentaron una secreción disminuida de IL-12 y IL-23, ambas importantes características de DCs tolerogénicas (Salazar et al., 2008, The Annals of the Rheumatic Diseases). Posteriormente, se demostró que la capacidad de las DCs de producir IL-10 y/o TGF-β es vital para interferir con CIA, así como también para inducir la expansión de células T CD4+ productoras de IL-10 y TGF-β en ratones tratados con una única dosis de DCs (Garate et al., 2012, enviado a publicación).

Con el fin de transferir parte de la experiencia usando el modelo murino CIA, nuestras investigaciones se extendieron al desarrollo de DCs tolerogénicas humanas. Así, trabajando con células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos y de pacientes con artritis reumatoide (AR), en presencia de GM-CSF e IL-4, seguido de una estimulación con dexametasona y una activación final con monofosforil lípido A (MPLA, un derivado no tóxico del LPS), se han generado DCs derivadas de monocitos con propiedades tolerogénicas (TolMo-DCs). Las TolMo-DCs expresan bajos niveles de moléculas co-estimuladoras (CD86 y CD80) y activadoras (CD40 y CD83) comparadas con DCs crecidas en presencia de sólo MPLA. Asimismo, al igual que las DCs estimuladas con MPLA, las TolMo-DCs expresan elevados niveles de CCR7, un receptor que permite la llegada de las DCs al tejido linfoide secundario, y como consecuencia montar un respuesta inmune. Adicionalmente, las TolMo-DCs despliegan un perfil de secreción de citoquinas anti-inflamatorio, con una producción de IL-12 baja e IL-10 elevada. El fenotipo descrito para las TolMo-DCs demostró ser estable luego que éstas fueron tratadas con MPLA.

Adicionalmente, se trabaja en definir los auto-antígenos más adecuados para cargar las TolMo-DCs, de modo de inducir tolerancia antígeno específica en pacientes con AR. Como fuente de auto-antígenos, el uso de colágeno tipo II y fluido sinovial aparecen como los candidatos más prometedores.

- Mecanismos inmunológicos involucrados en el uso de terapias basadas en anticuerpos para el tratamiento de artritis reumatoide.

Esta línea de investigación está direccionada a conocer los mecanismos inmunológicos subyacentes en la respuesta clínica favorable observada en pacientes con AR que reciben terapias basadas en anticuerpos, dirigidos a bloquear citoquinas o los receptores de éstas.

De este modo, recientemente hemos demostrado que los pacientes con AR que recibieron Adalimumab, un anticuerpo humano bloqueador de TNF-α, mostraron una disminución de las subpoblaciones de linfocitos Th1 y Th17, y de los linfocitos T CD8+ productores de IFN-gamma. Contrariamente, estos mismos pacientes mostraron un franco aumento de sus linfocitos T reguladores (Tregs) y de las células NK productoras de IFN-gamma (Aravena y Pesce 2011, Immunobiology).

Actualmente, empleando Tocilizumab, un anticuerpo humano contra el receptor de IL-6, se estudia en pacientes con AR tratados con este fármaco el efecto que éste posee sobre las subpoblaciones de células Th1, Th17, NK y Tregs, entre otras. Asimismo, se evalua si los cambios en el balance de las distintas subpoblaciones guarda relación con la mejoría clínica observada en la mayoría de los pacientes, poniendo énfasis, además, en la búsqueda de potenciales predictores de seguimiento de estas terapias.


INVESTIGACIÓN BÁSICA EN CÁNCER GÁSTRICO

El objetivo principal de nuestra investigación es estudiar el efecto y describir uno de los mecanismos por el cual H. pylori e IL-10 modulan la función de las células NK durante la respuesta inmune contra el cáncer gástrico. Además, proponemos identificar un nuevo blanco terapéutico y desarrollar anticuerpos completamente humanos que puedan conducir a un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de esta enfermedad.

Los datos disponibles muestran que LPS de E. coli y H. pylori aumentan la expresión de diferentes moléculas que activan células NK, como los ligandos de NKG2D (NKG2DLs) en líneas celulares de adenocarcinoma gástrico, mientras que la citoquina inmunomoduladora IL-10 disminuye la expresión de estas moléculas en las mismas células tumorales. Estos datos sugieren que, mediante la regulación de la expresión de NKG2DLs, un entorno enriquecido en IL-10 (el que disminuiría la expresión de NKG2DLs), así como la presencia de infección por H. pylori (que induciría la expresión crónica de NKG2DLs), podrían favorecer estrategias de evasión inmune por células malignas.

Nuestros resultados apuntan a conocer un posible mecanismo de inhibición de la citotoxicidad de las células líticas, como las células NK, y comprender mecanismos que estén involucrados en la respuesta inmune al cáncer gástrico y desarrollo de tumores. Adicionalmente, estamos desarrollando un ensayo ELISA que nos permita cuantificar los NKG2DLs MICA y MICB en suero de pacientes con cáncer gástrico, además de analizar si existe alguna correlación entre la concentración de estas moléculas en la sangre y la evolución de la enfermedad.

Por otro lado, también hemos observado que pacientes con adenocarcinoma gástrico con tamaño tumoral aumentado presentan, en las células tumorales, mayor expresión de NKG2DLs (más específicamente MICA y ULBP-3) que pacientes con tumores más pequeños. Como un tamaño tumoral aumentado está correlacionado con un peor pronóstico de la enfermedad (Ribeiro et al., 2012, enviado a publicación) estos resultados sugieren que MICA y ULBP-3 podrían ser interesante blancos terapéuticos como complemento para el tratamiento del cáncer gástrico avanzado.


DESARROLLO DE UN QRT-PCR PARA LA CUANTIFICACIÓN DE TRANSCRIPTO DE ERBB3 COMO UNA MOLÉCULA BLANCO A SER UTILIZADA EN INMUNOTERAPIA ANTITUMORAL

Mediante el análisis de muestras frescas de tejido gástrico obtenidas a partir de gastrectomías de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico, se generó un perfil de expresión de receptores de crecimiento epidermal (erbB1, erbB2, erbB3 y erbB4), mediante RT-PCR.

Estas moléculas juegan un rol importante tanto en la proliferación como en diferenciación celular, y su gran importancia se debe a que la principal causa de muerte en cáncer son las complicaciones por metástasis.

Actualmente, se está desarrollando un QRT-PCR para cuantificar la cantidad de ErbB3 que permita tomar la decisión de dirigir al paciente a una terapia con anticuerpos anti ErbB3.

 

Servicios

Publicaciones

Anticuerpos recombinantes

Organizaciones de InterÉs